باکتری کشت یا کشت باکتری | انواع محیط کشت

باکتری کشت یا کشت باکتری | انواع محیط کشت

باکتری کشت یا کشت باکتری | انواع محیط کشت

باکتری کشت یا کشت باکتری | انواع محیط کشت :

کشت وتکثیر باکتریها

در محیط های مصنوعی از مهمترین روشهای تشخیصی در باکتری شناسی است . برای کشت موفق باید شرایط مناسب برای رشد باکتری فراهم گردد. ازجمله این شرایط مواد غذایی- حرارت-رطوبت کافی- نمک– PH مناسب- حضور یاعدم حضوراکسیژن می باشد. محیط های كشت را متناسب با نوع آزمایش ميتوان به دو صورت مایع و جامد تهیه كرد

۱محيط كشت مايع : محیط های مایع به علت نداشتن آگار در تركیب خود به صورت جامد در نیامده و متناسب با نوع میكروارگانیسم و آزمایشهاي مورد نظر ميتوان آنها را در لوله هاي آزمایش ـ ارلن مایر و یا ظروف دیگر مورد استفاده قرار داد. ۲.محيط كشت جامد : محیط های جامد به علت دارا بودن آگاردر تركیب خود به صورت جامد بوده و متناسب با میكروارگانیسم ها و آزمایش هاي مورد نظر ميتوان آنها را در لوله – ظروف پتري(پلیت) و یا ظروف دیگر مورد استفاده قرار داد. البته محیط های نیمه جامد نیز وجود دارد.که میزان آگار آن نسبت به محیط های جامد کمتر است

معرفی برخی از محيط های کشت مورد استفاده:

Blood agar

محیط کشت عمومی است که به منظور تکثیر و جدا سازی باکتری های بیماریزا بخصوص باکتری هایی که برای رشد به مواد مغذی نیاز دارند، بکار می رود. بعلاوه در این محیط وجود همولیزین در باکتری ها را نیز می توان کاوش کرد.

پس از اتوکلاو محیط پایه، هنگامی که درجه آن تا حدود ۵۰ درجه سانتیگراد رسید، خون دفیبرینه گاو را به نسبت ۵ تا ۷ درصد به آن اضافه نموده و با رعایت شرایط استریل در پلیت های استریل می ریزیم.

ممکن است بسته به نوع باکتری یکی از سه حالت ذیل مشاهده گردد:

۱- همولیز کامل β: باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده و اطراف پرگنه منطقه شفافی ایجاد می گردد.

۲- همولیز ناقص α: باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده ولی نسبت لیز کمتر از ۵۰ درصد می باشد و اطراف پرگنه هاله سبز رنگ ایجاد می گردد.

۳- عدم همولیزγ : باکتری فاقد آنزیم همولیزین می باشد.

محیط کشت آگار شکلاته (Chocolate agar)

اگر به محیط پایه آگار خوندار، هنگامی که درجه حرارت آن بعد از اتوکلاو در حدود ۸۰-۷۰ درجه سانتیگراد باشد، خون دفیبرینه گاو اضافه کنیم، محیط کشت آگار شکلاته بدست می آید. در این محیط بعلت اینکه گلبولهای قرمز خون در اثر حرارت متلاشی شده و اجزای آن خارج گشته، برای رشد باکتری هایی نظیر هموفیلوس و نایسریاها که نیاز بیشتری به مواد غذایی آماده دارند مناسب می باشد.

همانند محیط کشت آگار خوندار Blood agar بسته به نوع باکتری همولیز و یا همولیز ناقص و عدم همولیز ایجاد می گردد.

محیط کشت بریلیانت گرین آگار (Brilliant green agar)

محیطی است انتخابی و برای جداسازی گونه های سالمونلا بکار می رود. این محیط از رشد بسیاری از باکتری های روده ای (انتروباکتریاسه) به جز سالمونلا جلوگیری می نماید. در صورتی که E coli، کلبسیلا و پروتئوس و سایر انترو باکتریاسه ها رشد نمایند، به دلیل اینکه قند لاکتوز و یا سوکروز و یا هر دو را تخمیر می نمایند و تولید اسید می کنند، در مجاورت معرف رنگی فنل رد به رنگ زرد در می آیند. در صورتی که باکتری های لاکتوز منفی مانند سالمونلا رشد نمایند، به دلیل عدم تخمیر قند در مجاورت معرف، محیط به رنگ ارغوانی در می آید.

E.M.B   ائوزین متیلن بلو آگار

 نوعي محیط کشتی است كه براي تشخیص و جداسازي باكتري هاي میله اي روده اي گرم منفي استفاده مي شود. همچنین ائوزین متیلن بلو آگار مانع از رشد باكتري هاي گرم مثبت مي شود.ولی برخی گرم مثبت ها مانند استافیلوکوک های کواگوالز مثبت و برخی مخمر ها )کاندیدا آلبیکنس) می توانند در این محیط رشد کنند. مبناي افتراق در این محیط بكارگیري دو رنگ شاخص یعني ائوزین و متیلن بلواست كه متمایزكننده تخمیركننده هاي لاکتوز ازارگانیسمهاي فاقد توانایي تخمیر لاکتوز مي باشد. در این محیط باكتري هاي تخمیر كننده لاکتوز داراي كلني هایي قرمز پر رنگ و ارغوانی تا بنفش خواهند بود در حالیكه ارگانیسم هایي كه نمي توانند لاکتوز را تخمیركنند كلني هاي كاملا بي رنگ یا هم رنگ محیط خواهند داشت. .coli.Eدر این محیط جلای سبز فلزی خواهد داشت.

Hektoen Enteric agar  هكتون انتریک آگار

 محیطي انتخابي براي جداسازي و ترمیم نمونه هاي مدفوعي متعلق به باكتري هاي روده اي به ویژه سالمونلا و شیگلا است. این محیط باكتري هاي تخمیركننده لاکتوز را از آنهایي كه نمي توانند از تخمیر لاکتوز ، اسید تولید كنند با ایجاد رنگ زرد – نارنجي روي محیط مناسب در حضور شاخص pH متمایز مي كند . باكتري هایي كه لاكتوز راتخمیر نمي كنند، روي محیط تغییر رنگ ایجاد نمي دهند. هكتون انترین آگارمي تواند تولید گاز هیدروژن سولفید را با تیره نمودن بخش هایي از محیط نشان دهد.

Macconkey agar   مک كانكي آگار

محیطی جامد براي متمایز كردن جمعیت زیادي ازمیكروبها است.این محیط اهمیت كاربردي زیادي در شناسایي تخمیركننده هاي لاكتوز، پاتوژن هاي روده اي گرم منفي دارد.این محیط شامل پپتون, بافر,لاکتوز,کریستال ویوله,املاح صفراوی و معرف نوترال رد است که مانع رشد باكتریهاي گرم مثبت می شود. كلني باكتري هاي تخمیركننده لاكتوز،محیط را به رنگ قرمز درمي آورند.رنگ قرمز درنتیجه ایجاد محیط اسیدي بوسیله تخمیر كننده هاي لاكتوز شكل مي گیرد.ارگانیسم هایي كه نمي توانند لاكتوز را تخمیر كنند، سبب تغییر رنگ نمي شوند.در واقع همرنگ با محیط می شوند.

محیط کشت سابور دکستروز آگار sabouraud dextrose agar

محیط انتخابی برای تکثیر قارچها می باشد که بسیاری از باکتری ها نیز در این محیط رشد می کنند. انتخابی بودن این محیط برای قارچها بر اساس PH پایین و همچنین مواد غذایی ناچیز آن است.

mannitol salt agar test

این محیط انتخابی براي تمایز استافیلوكوكهاي پاتوژن مانیتول سالت آگار است. غلظت بالاي نمک در این محیط مانع از رشد بیشتر میكروارگانیسمها مي شود.نه تنها استافیلوكوک هاي پاتوژن مي توانند در این محیط رشد كنند بلكه آنها در این محیط اسید هم تولید مي كنند.این اسید تولید شده به عنوان شاخص pH  موجب تغییر رنگ محیط از قرمز به زرد مي شود. استافیلوكوک هاي غیر پاتوژن نیز قادر به رشد در این محیط هستند ولي نمي توانند اسید تولید كرده رنگ آن را تغییر دهند.

mueller hinton agar

این محیط به عنوان یک محیط مغذی پایه برای بررسی آنتی بیوگرام مناسب است برای تهیه این محیط پس ازحل نمودن پودر دهیدراته محیط درآب مقطر و اتوکلاو نمودن , محیط را در پلیت های استریل تقسیم نمایید

S I M.Medium

محیطی نیمه جامد که از این محیط برای بررسی حرکت باکتری, توانایی احیای گوگرد و تولید SH2, تست اندول استفاده می شود.

shigelle agar SS,  agar Salmonella

این محیط از رشد باکتریهای گرم مثبت و بسیاری از باکتریهای گرم منفی جلوگیری می کند و به عنوان یک محیط انتخابی برای جداسازی سالمونلا و شیگلا بخصوص از نمونه مدفوع بسیار مناسب است.این محیط حاوی عصاره گوشت ,لاکتوز ,پپتون ,املاح صفراوی ,برلیانت گرین ,سیترات ,آگار ,تلوریت سدیم یا پتاسیم, و معرف نوترال رد است.

TSI, Triple sugar iron agar

این محیط حاوی سه قند گلوگز و لاکتوز و سوکروز است با این تفاوت که میزان گلوگز آن 1%میزان دو قند دیگر است.علاوه بر این قند ها این محیط حاوی پپتون ,تیو سولفات,آهن,آگار,بافر و معرف فنل رد است.روش کشت در این محیط به صورت عمقی و خطی است. و از این محیط برای نشان دادن تخمیر قند ها و تولید H2S,CO2 استفاده می شود و نتایج در دو بخش سطح و عمق لوله مورد بررسی قرار می گیرد.و به صورت اسیدی و قلیایی گزارش می شود. اگر باکتری از قند استفاده کرده باشد تمام لوله اسیدی و به رنگ زرد دیده می شود و درغیر این صورت تمام لوله قلیا یی و قرمز خواهد بود. اسیدی شدن را با حرف A و قلیایی شدن را با  Alk نشان می دهیم.

: A/Aتمام لوله زرد است و باکتری تمام قند را مصرف کرده و سبب اسیدی شدن محیط شده است.

: A/Alkاین حالت در طی 72 ساعت نشان دهنده مصرف تنها گلوگز است و بقیه قند ها مصرف نشده اند.

: Alk/Alkهیچ قندی مصرف نشده و محیط تغییر رنگ نمی دهد و شرایط قلیایی است. اگر باکتری در این محیط قادر به استفاده از تیو سولفات سدیم باشد H2S تولید می کند که با املاح آهن موجود در محیط رسوب سیاه رنگ خواهد داد. همچنین اگر تخمیر قند با تولید CO2 همراه باشد, حباب و ترک خوردن و حتی جابجایی محیط را خواهیم داشت.

Lysine iron agar

از این محیط برای بررسی توانایی باکتری در دکربوکسیالسیون و دآمیناسیون لیزین استفاده می شود.محیط مزبور را پس از تهیه در لوله های استریل تقسیم نموده و لوله را به صورت شیب دار قرار دهید تا محیط به آرامی سرد و منجمد شود.

Kligler iron agar

 از این محیط برای بررسی توانایی باکتری در تخمیرقند گلوکز و لاکتوز استفاده می شود . پس از تهیه محیط حدود 5 تا 7 میلی لیتر از محیط را در لوله های استریل تقسیم نموده و لوله را به صورت شیب دار قرار دهید تا محیط به آرامی سرد و منجمد شود .

Dnase test agar

در این محیط فعالیت آنزیم دزوکسی ریبو نوکلئاز بررسی می شود. این آنزیم به پیوند های DNA حمله می کند این آنزیم یک آنزیم خارج سلولی است که مقاوم به حرارت بوده و برای شناسایی برخی باکتری ها مثل استاف اوروئوس می توان از این محیط استفاده کرد.

Endo agar

محیط جامدی است برای جدا سازی کلی فرم ها و سایر باسیل های روده از آب و غذا و سایر نمونه های کلینیکی.

Bile Esculine agar

 این محیط به علت دارا بودن اسکولین وصفرا برای شناسایی انتروکوک ازسایر استرپتوکوکها بسیار مناسب است. دراین محیط صفرا به برخی از استرپتوکوکها ازجمله انتروکوک اجازه رشد می دهد وباعث لیز بسیاری از استرپتوکوکها می شود و در صورتی که باکتری قادر به هیدولیز اسکولین باشد گلوکز و اسکولتین (یک مولکول الکلی می باشد) آزاد می شود سپس اسکولتین با یون فریک موجود در محیط ایجاد کمپلکس سیاه رنگ می شود.

 محیط کشت متیل رد – وژوسپروسکار Methyl red-Vegesproskaure broth) MR-VP)

این محیط ملاک آزمایشی می باشد برای تفکیک مسیرهای تخمیر گلوکز و نهایتا ایجاد ترکیبات اسیدهای آلی بوتاندیول یا بوتیلن گلایکول بوده که از این آزمایش در تفکیک و تشخیص کلی فرم ها از هم مورد استفاده قرار می گیرد. همچنین در تمایز بین استافیلوکوک و میکروکوک و گونه های آن از این محیط استفاده می شود.

آزمایشMR: پس از انجام کشت و انکوباسیون ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۴۸ ساعت، مقدار ۶/۰ میلی لیتر معرف رنگی متیل رد اضافه نموده و در صورت ظهور رنگ قرمز آزمایش MR مثبت می باشد. در صورت پیدایش رنگ نارنجی آزمایش MR مثبت ضعیف می باشد و در صورت عدم تغییر و پایداری رنگ زرد آزمایش MR منفی می باشد.

نتیجه:

ظهور رنگ قرمز: آزمایش مثبت (PH=4/4)

ظهور رنگ نارنجی: آزمایش مثبت ضعیف (PH=5/3)

ظهور رنگ زرد: آزمایش منفی (PH=5/3)

طرز تهیه معرف MR

1- متیل رد ۰۴/۰ گرم

۲- اتانول ۴۰ میلی لیتر

۳- آب مقطر ۱۰۰ میلی لیتر

متیل رد را در اتانول حل نموده و به حجم ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم.

آزمایش VP: به لوله کشت داده شده و انکوبه شده حدود ۶/۰ میلی لیتر معرف آلفا نفتول (معرف A) و مقدار ۲/۰ میلی لیتر محلول پتاس (معرف B) اضافه کرده و خوب تکان می دهیم. اگر تغییر رنگ صورت نگرفت آن را به مدت سی دقیقه به حال خود گذاشته و در صورتی که ظهور رنگ صورتی تا قرمز پدیدار شود، آزمایش VP مثبت و اگر تغییر رنگی صورت نپذیرد، آزمایش VP منفی خواهد بود.

نتیجه:

مثبت: ظهور رنگ صورتی تا قرمز

منفی: تغییر رنگی صورت نمی گیرد.

طرز تهیه معرف VP:

معرف A:

1- آلفانفتول: ۵ گرم

۲- الکل اتلیک مطلق: ۱۰۰ میلی لیتر

محلول نباید تیره تر از رنگ کاه (نی) شود. در صورت لزوم باید مجددا تقطیر گردد.

معرف B:

1- هیدروکسید پتاسیم: ۴۰ گرم

۲- آب مقطر: ۱۰۰ میلی لیتر

محیط کشت فلچر Fletcher’s medium

این محیط برای جداسازی و نگهداری لپتوسپیراها بکار می رود. پس از استریلیزه کردن و خنک نمودن محیط، به آن ۸۰ میلی لیتر سرم خرگوش استریل اضافه نموده، سپس به مقدار ۷-۵ میلی لیتر در لوله های استریل ریخته به مدت ۳۰ دقیقه در حرارت ۵۶ درجه سانتیگراد قرار می دهیم تا عامل مکمل موجود در سرم غیر فعال گردد.

برای جداسازی لپتوسپیرا، نمونه های خون-ادرار و نسج مشکوک را در این محیط کشت داده و در حرارت ۲۹ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ روز انکوبه می نماییم. متناوبا از کشت گسترش تهیه کرده و بوسیله میکروسکوپ با زمینه تاریک کشت را کنترل می نماییم.

در اثر تکثیر لپتوسپراها کدورت جزئی در محیط به وجود می آورند که پیدایش یک حلقه شیری رنگ در قسمت بالای محیط می تواند حاکی از رشد لپتوسپرا باشد.

محیط کشت Cooked meet

این محیط کشت به دلیل داشتن پارافین، باعث رشد باکتری های بی هوازی می گردد. این محیط کشت محیطی مغذی و غنی برای باکتری های بی هوازی مانند کلستریدیوم است. این محیط معرف خاصی نداشته و هدف ایجاد محیط کشت مناسب برای باکتری های بی هوازی است. بعد از رشد باکتری برای تفریق باید بر روی محیط های افتراقی با شرایط بی هوازی جهت تشخیص باکتری مورد نظر پرداخت.

محیط کشت ژلاتین Gelatin medium

این محیط به منظور تعیین فعالیت پروتئولیتیکی باکتری ها می باشد. باکتری های پروتئولیتیک همیشه باکتری ها را ذوب می کنند. در صورتی که کشت ژلاتین در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد قرار داده شود، باید قبل از قرائت لوله های حاوی کشت ژلاتین را در دمای یخچال ۴ درجه به مدت ۱۵ دقیقه قرار داده، در صورتی که باکتری آنزیم ژلاتیناز را داشته باشد، لوله های کشت ژلاتین پس از انکوباسیون در یخچال به صورت مایع خواهند بود. در غیر اینصورت باکتری فاقد آنزیم ژلاتیناز می باشد.

توجه: نقطه ذوب محیط ژلاتین ۳۰-۲۰ درجه سانتی گراد می باشد.

محیط کشت (Oxidative Fermentative) OF

با کشت باکتری در این محیط می توان مشخص نمود که استفاده باکتری از کربوهیدرات از طریق اکسیداسیون یا از طریق تخمیر صورت کرفته است. این محیط را در دو قسمت، یکی حاوی پارافین و دیگری فاقد پارافین تهیه نموده و از نمونه در هر دو محیط کشت می دهیم. در صورتی که باکتری تنها از طریق اکسیداسیون قند را مورد استفاده قرار دهد، تنها در لوله فاقد پارافین، قند را مصرف کرده و محیط را اسیدی نموده، که در مجاورت معرف بروموتیمول بلو به رنگ زرد در می آید. رنگ زرد از بالای لوله شروع می شودکه باکتری از طریق فرمنتاتیو قندها را تخمیر نماید، هر دو لوله کشت (حاوی پارافین و فاقد پارافین) بر اثر تولید اسید شاهد ظهور رنگ زرد خواهیم بود. از محیط OF می توان در تمایز کوکسی های گرم مثبت بخصوص استافیلوکوک اورئوس استفاده نمود.

تست اکسیداز Oxidase test

قطره معرف اکسیداز (محلول آبی تترامتیل-فسفات-فنیل آلانیل دی هیدروکلراید) را روی یک کاغذ صافی در یک پلیت قرار داده (قطرات روی کاغذ صافی خشک شوند) و میکروب مورد آزمایش را با یک سیم پلاتینیوم Platinium wire برداشته و آن را روی کاغذ آغشته به معرف اکسیداز گسترانیده و واکنش مثبت در مدت ۱۰ ثانیه بصورت ایجاد رنگ سیاه مایل به صورتی مشاهده می گردد.

آزمایش کواگولاز    Coagulase test

با استفاده از این آزمایش می توان وجود آنزیم کواگولاز در باکتری استافیلوکوک اورئوس را مشخص نمود. آنزیم کواگولاز آنزیمی است که باعث لخته شدن پلاسمای سیتراته خرگوش می شود. با توجه به اینکه سیترات ماده ضد انعقاد می باشد، اما کواگولاز می تواند حتی در حضور ماده ضد انعقاد، پلاسما را لخته نماید. (فیبرینوژن را به فیبرین تبدیل نماید.)

تست کاتالاز   Catalase test

با استفاده از این تست می توان وجود آنزیم کاتالاز را در باکتری مشخص نمود. در صورتی که باکتری واجد آنزیم کاتالاز باشد، با اضافه کرن آب اکسیژنه به کلنی برداشته شده باکتری بر روی لام، واکنش انجام شده به صورت تولید آب و اکسیژن بوده که به صورت حباب هایی نمایان می گردد. در صورتی که باکتری فاقد آنزیم کاتالاز باشد، بعد از اضافه نمودن آب اکسیژنه، هیچ گونه تغییری در تولید حباب حاصل از تجزیه آب اکسیژنه به آب و اکسیژن ایجاد نمی گردد و در نهایت باکتری کاتالاز منفی می باشد.

محیط کشت سیمون سیترات آگار Simmons Citrate agar

برای تعیین قدرت باکتری در استفاده از سیترات به عنوان تنها عامل کربندار موجود در محیط میباشد. باکتری هایی که قادر به رشد در این محیط باشند در حقیقت توانسته اند از سیترات که تنها عامل کربن دار در محیط است استفاده کنند و در نتیجه در مجاورت معرف رنگی بروموتیمول بلو به رنگ آبی در می آیند. در غیر این صورت به علت عدم رشد باکتری و عدم تغییر رنگ محیط آزمایش سیترات منفی است.

سفیر آزما کیان بزرگترین واردکننده و فروشنده انواع آنتی بادی، آنتی ژن، پادتن ، آنزیم و محیط کشت در ایران می باشد.

تلفن های مشاوره و تماس :

0935700774302166074277

Leave Your Comment

Your email address will not be published. Required fields are marked *